date:2022-11-14 15:25:09
細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的一門(mén)學(xué)科。顧名思義，它致力于研究生物。單憑這一事實(shí)就足以成為研究細(xì)胞自然生存狀態(tài)的理由。當(dāng)然，活細(xì)胞成像還有其他深層次的原因。在本篇文章中，我們列舉了用延時(shí)顯微鏡研究活細(xì)胞是有意義的五大很好的理由。
背景
活細(xì)胞成像允許在一定時(shí)間內(nèi)在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)觀察。各種顯微鏡技術(shù)適用于活細(xì)胞成像：例如，可以采用無(wú)標(biāo)記的技術(shù)，如相差，DIC，或干涉測(cè)量法，也可以依靠熒光顯微鏡，利用熒光標(biāo)記標(biāo)記和可視化細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)、分子或蛋白質(zhì)。當(dāng)然，活細(xì)胞成像也面臨挑戰(zhàn)，在建立活細(xì)胞圖像實(shí)驗(yàn)時(shí)需要考慮某些要求。最重要的是，必須確保顯微鏡配備了一個(gè)stage top 培養(yǎng)箱，能夠提供理想的環(huán)境，使細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)保持存活和健康。
圖1.A：活細(xì)胞成像過(guò)程中需要考慮和控制的環(huán)境參數(shù)
圖1.B：倒置顯微鏡的臺(tái)頂培養(yǎng)箱示意圖
參數(shù)和環(huán)境條件是此類實(shí)驗(yàn)的重要部分，我們將在以后的公眾號(hào)中討論。如果您有興趣，可以在本篇文章中查看更多相關(guān)內(nèi)容。在此我們已經(jīng)介紹了基本知識(shí)，接下來(lái)我們將繼續(xù)深入探討為什么您應(yīng)該使用活細(xì)胞成像來(lái)研究您的細(xì)胞：
1.避免固定過(guò)程中的人工制品
細(xì)胞通常在顯微鏡觀察前固定（如免疫熒光），以保存在逼真的狀態(tài)。多年來(lái)，許多不同的化學(xué)和物理程序已被優(yōu)化和建立，以保持原始樣品的質(zhì)量。然而，固定過(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害（當(dāng)然在這個(gè)過(guò)程之后，它們會(huì)死亡），并不可逆轉(zhuǎn)地改變其組織、結(jié)構(gòu)和形態(tài)（細(xì)胞器收縮、蛋白質(zhì)定位錯(cuò)誤等）。然而，活細(xì)胞成像可以讓我們研究活細(xì)胞。這意味著他們應(yīng)該展示他們的自然形態(tài)，這仍然會(huì)受到熒光標(biāo)簽、激光等的影響，但這就像環(huán)境條件一樣，是一個(gè)不同的狀況。
2.觀察和分析動(dòng)態(tài)過(guò)程
活細(xì)胞成像使我們能夠觀察整個(gè)細(xì)胞群、單個(gè)細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)事件。當(dāng)固定細(xì)胞將其鎖定在特定時(shí)間點(diǎn)的特定（行為或結(jié)構(gòu)）狀態(tài)時(shí)，對(duì)活細(xì)胞的顯微鏡觀察可以洞察整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程?；诠δ苄约?xì)胞的檢測(cè)，如損傷和遷移（圖2）或趨化實(shí)驗(yàn)是活細(xì)胞成像應(yīng)用的很好的例子。這些分析使得研究細(xì)胞對(duì)化學(xué)（趨化性）或機(jī)械（傷口愈合）刺激的反應(yīng)成為可能。
圖2：使用ibidi Stage Top孵育系統(tǒng)的活細(xì)胞成像顯示了傷口愈合和遷移試驗(yàn)中MCF7細(xì)胞的間隙閉合。相差；10倍物鏡。
3.實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)胞變化
活細(xì)胞顯微鏡是實(shí)時(shí)了解細(xì)胞隨時(shí)空變化的一種有價(jià)值的方法，而不是依賴于固定細(xì)胞的端點(diǎn)的分析結(jié)果。通過(guò)使用延時(shí)視頻顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的跟蹤，可以捕捉到結(jié)構(gòu)重排的動(dòng)態(tài)(如圖3，感受趨化刺激后細(xì)胞骨架的極化), 或使用固定細(xì)胞可能會(huì)錯(cuò)過(guò)的瞬時(shí)細(xì)胞性活動(dòng)(如，有絲分裂期間的染色體分離)。
圖3：應(yīng)用趨化梯度后，表達(dá)LifeAct的原代樹(shù)突狀小鼠細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的活細(xì)胞成像
4. 研究單分子動(dòng)力學(xué)、定位和相互作用
先進(jìn)熒光標(biāo)記和成像技術(shù)的發(fā)展，如光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)（FRAP）、熒光壽命成像顯微技術(shù)（FLIM）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET），使活細(xì)胞成像過(guò)程中單分子定位、動(dòng)力學(xué)和相互作用的觀察和分析成為可能。
FRAP可以測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記分子和蛋白質(zhì)的遷移率。FLIM通過(guò)測(cè)量附著的熒光團(tuán)的壽命來(lái)提供有關(guān)細(xì)胞分子分布及其環(huán)境的信息。
利用FRET，人們可以通過(guò)檢測(cè)兩個(gè)分子在納米級(jí)相互接近時(shí)所附熒光團(tuán)的相互作用來(lái)測(cè)量活細(xì)胞中兩個(gè)分子的直接相互作用。
5. 從單個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲取更多信息
總的來(lái)說(shuō)，如果您進(jìn)行活細(xì)胞成像，您可以從單個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得比從固定細(xì)胞成像更多的信息。這是因?yàn)榛罴?xì)胞成像使人們能夠跟蹤分子動(dòng)力學(xué)和動(dòng)力學(xué)，并提供了您感興趣的一個(gè)更大、更全面的細(xì)胞過(guò)程圖像。
對(duì)固定樣本的分析通常只提供某個(gè)細(xì)胞性活動(dòng)的快照，而跟蹤整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程使人們能夠從單個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)量更多參數(shù)，并得出更多不同的結(jié)論。
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活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的要求與設(shè)置 實(shí)驗(yàn)示例
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