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　　計(jì)劃您的實(shí)驗(yàn)

　　

　　

　　

　　啟動(dòng)3D培養(yǎng)首先通過機(jī)械和酶消化分離細(xì)胞。選擇合適的酶和條件對(duì)于有效的細(xì)胞解離和活力至關(guān)重要，但處理時(shí)間和環(huán)境溫度等因素也至關(guān)重要。該過程通常包括用無菌剪刀分離組織、用膠原酶酶解和均質(zhì)化。其目的是獲得均勻的單細(xì)胞懸液，通常涉及通過熒光活化細(xì)胞分選（FACS）或磁活化細(xì)胞分選（MACS）進(jìn)行純化?；蛘撸糜谏汕蝮w的細(xì)胞，如癌細(xì)胞系（可從供應(yīng)商處購買）。通常最好立即培養(yǎng)3D細(xì)胞，盡管存在冷凍特定細(xì)胞類型的方案。

　　

　　目前存在幾種聚集和培養(yǎng)3D細(xì)胞的方法。雖然球體培養(yǎng)遵循嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化的方案，但類器官培養(yǎng)通常需要對(duì)現(xiàn)有程序進(jìn)行更仔細(xì)的修訂。除了這些無支架方法外，基于支架的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型也得到廣泛應(yīng)用。這些模型采用生物相容性支架，提供細(xì)胞可以附著、生長并組織成三維結(jié)構(gòu)的支持性基質(zhì)。

　　

　　

　　

　　選擇最合適的成像方法通常取決于研究問題、可用資源和專業(yè)知識(shí)。雖然相差顯微鏡足以進(jìn)行活力測(cè)試但，熒光顯微鏡的復(fù)雜抗體染色通常用于分析細(xì)胞聚集體的結(jié)構(gòu)和組成。為了獲得最佳圖像，固定和染色方案的詳細(xì)規(guī)劃和優(yōu)化至關(guān)重要。共聚焦顯微鏡提供了高分辨率的光學(xué)切片，以闡明類器官和球體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。多光子顯微鏡提供了更深的組織穿透力和降低的光毒性，使其成為較厚標(biāo)本和長期活細(xì)胞成像的理想選擇。

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　3D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的典型讀數(shù)包括分析分泌和細(xì)胞內(nèi)生物分子，還包括評(píng)估活力、生長、分化以及與其他細(xì)胞、生物體或化合物的相互作用。各種定量下游分析包括代謝測(cè)量、毒理學(xué)篩選、轉(zhuǎn)錄組分析等。即使從少量細(xì)胞中分離生物分子也有方法，而成像讀數(shù)通常需要更細(xì)致的準(zhǔn)備和專門的設(shè)備。

　　

　　

　　有效的計(jì)劃對(duì)3D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。這個(gè)過程從設(shè)定明確的研究目標(biāo)和選擇合適的細(xì)胞類型開始。細(xì)胞分離和培養(yǎng)方案的選擇至關(guān)重要，這些方案應(yīng)不斷完善。方案調(diào)整包括優(yōu)化培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度和CO2/O2水平，以及選擇最適合3D生長的基質(zhì)。此外，整合先進(jìn)的培養(yǎng)方法，如動(dòng)態(tài)流動(dòng)條件，使用芯片仿真人體器官系統(tǒng)或復(fù)雜的生物打印方法探索多器官串?dāng)_，可以進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平。

　　

　　類器官和球狀體之間的選擇應(yīng)與研究問題、可用資源和既定方案相一致。類器官提供了復(fù)雜的、類似器官的結(jié)構(gòu)，適合于全面的組織研究，但需要更多的專業(yè)知識(shí)和資源。球狀體更簡(jiǎn)單，在腫瘤研究和高通量藥物篩選中至關(guān)重要，并且通?？刹捎酶叱杀拘б娴姆椒?。

　　

　　最后，規(guī)劃好實(shí)際的結(jié)果輸出也很重要，包括數(shù)據(jù)收集和分析，因?yàn)檫@些會(huì)影響培養(yǎng)方法和條件。獲得高質(zhì)量讀數(shù)的關(guān)鍵因素是細(xì)胞培養(yǎng)表面與成像技術(shù)的兼容性。傳統(tǒng)的表面通常在細(xì)胞粘附或光學(xué)清晰度方面存在挑戰(zhàn)，影響了先進(jìn)成像方法的效果。與此相補(bǔ)充的是，ibidi µ-Slides, µ-Dishes,和µ-Plates的特點(diǎn)是組織培養(yǎng)處理(ibiTreat)蓋玻片底部具有優(yōu)異的光學(xué)質(zhì)量。這些產(chǎn)品可選擇具有各種表面的，并且可以在與標(biāo)準(zhǔn)塑料實(shí)驗(yàn)室器具類似的工藝進(jìn)行涂層，同時(shí)完全保持圖像質(zhì)量。

　　

　　

　　人腸成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在µ-Slide 4 Well4孔腔室載玻片中培養(yǎng)的纖維蛋白水凝膠中發(fā)芽。內(nèi)皮細(xì)胞用抗cd31染色(黃色)，成纖維細(xì)胞用抗波形蛋白染色(紅色)，細(xì)胞核用DAPI染色(青色)。共聚焦圖像由：葡萄牙 波爾圖大學(xué) 生物工程3D微環(huán)境組的H. Nogueira Pinto提供