在藥物研發(fā)領(lǐng)域，您可能聽說過高內(nèi)涵篩選(HCS)以及與其密切相關(guān)的術(shù)語：高內(nèi)涵成像(HCI)和高內(nèi)涵分析(HCA)。但“高內(nèi)涵”到底是什么意思？這些概念彼此之間有何不同？
這些術(shù)語經(jīng)常與高通量篩選(HTS)的基本概念一起被提及，高通量篩選采用龐大的自動化機器人系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，能夠測試數(shù)十萬到數(shù)百萬種化合物，從而有效縮小潛在候選藥物的范圍。在HTS的基礎(chǔ)上，高內(nèi)涵篩選(HCS)通過結(jié)合先進的顯微鏡和成像技術(shù)，進一步提高了這些能力，您可以測量許多不同的端點或輸出，而不是僅僅測量一個端點。
本篇文章探討了高內(nèi)涵篩選（一個涵蓋高內(nèi)涵成像和高內(nèi)涵分析的總稱）如何通過捕獲顯示細胞對化合物反應(yīng)的表型數(shù)據(jù)來增強藥物研發(fā)過程。
高內(nèi)涵成像 (HCI)：增強可視化
高內(nèi)涵篩選的核心是高內(nèi)涵成像(HCI)，這是一種基于圖像的高通量方法，利用共聚焦顯微鏡、活細胞成像和自動多色熒光成像等顯微鏡技術(shù)。這種方法能夠詳細捕獲細胞樣本，從而同時分析2D和3D細胞培養(yǎng)中單個細胞的多個分子特征。從本質(zhì)上講，HCI提高了藥物發(fā)現(xiàn)中細胞分析的深度和準確性，使科學家能夠從細胞對潛在治療化合物的反應(yīng)中獲得有價值的見解。以下是HCI在高內(nèi)涵篩選中的主要應(yīng)用：
1. 檢測方法開發(fā)
通過提供詳細的可視化，HCI幫助研究人員設(shè)計可靠的檢測方法，可以準確測量特定的生物過程或終點，例如與疾病相關(guān)的細胞檢測。這些檢測方法可提供精確的測量并監(jiān)測表型變化，從而有助于優(yōu)化早期發(fā)現(xiàn)工作。例如，高通量管形成檢測可作為一種體外工具，以簡單、經(jīng)濟高效且可重復(fù)的方式評估血管生成，從而利用細胞的管形成能力來分析各種藥物的促血管生成或抗血管生成潛力。同樣，傷口愈合和遷移檢測有助于分析不同條件下的細胞遷移，使其成為研究人員工具包中的寶貴補充。
除此之外，HCI還使研究人員能夠生成既可預(yù)測又可轉(zhuǎn)化為體內(nèi)效應(yīng)的臨床前數(shù)據(jù)，尤其是與患者相關(guān)的3D類器官培養(yǎng)物相結(jié)合時。這種先進成像技術(shù)與3D類器官模型之間的協(xié)同作用提高了臨床前評估的可靠性。
ibidi憑借µ-Plate 96 Well 3D為高通量管形成和3D細胞培養(yǎng)分析提供了解決方案。它提供了出色的細胞可視化效果，無彎液面，從而確保了可重復(fù)的細胞培養(yǎng)條件。即用型Culture-Insert 2 Well 24非常適合可重復(fù)的高通量傷口愈合和遷移分析。它由已插入µ-Plate 24 Well 的具有明確無細胞間隙的硅膠Culture-Insert插件組成。
2. 大規(guī)模轉(zhuǎn)染試驗
HCI廣泛應(yīng)用于大規(guī)模轉(zhuǎn)染試驗，是評估基因轉(zhuǎn)染到細胞系統(tǒng)的有效性和效果的重要工具。HCI能夠可視化和量化基因表達，使研究人員能夠微調(diào)轉(zhuǎn)染方案、了解基因功能并探索分子相互作用。
人類誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSC)衍生的神經(jīng)元用MAP2染色，MAP2是細胞體和近端樹突的標記。神經(jīng)元通過神經(jīng)原素2誘導(dǎo)分化，并與小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)30天。每個方格都從ibidi µ-Plate 96孔方格的單獨孔中記錄。圖像記錄在具有10倍物鏡的高內(nèi)涵共聚焦成像系統(tǒng)上。圖片由美國馬薩諸塞州劍橋Q-State Biosciences, Inc. 的Chris Hempel提供。
3. 化合物篩選
通過HCI，研究人員可以仔細研究化合物對細胞行為各個方面的影響，包括細胞形態(tài)、蛋白質(zhì)表達和亞細胞定位等，所有這些都可以同時進行評估。這種多方面的分析有助于精確定位具有所需特性的化合物，從而高效、準確地推進藥物研發(fā)工作。
例如， Schuth等人進行的研究強調(diào)了個性化PDAC共培養(yǎng)模型在全面分析藥物反應(yīng)和闡明導(dǎo)致腫瘤基質(zhì)介導(dǎo)化學耐藥性的分子機制方面的潛力。利用高內(nèi)涵成像技術(shù)有助于揭示共培養(yǎng)環(huán)境中這些復(fù)雜的相互作用，為PDAC病理生物學和治療策略提供寶貴見解。
PDAC-PDO單一培養(yǎng)和PDAC-PDO/CAF共培養(yǎng)的已建立藥物測試工作流程示意圖
4. 毒理學研究與安全性評估
HCI已成為毒性研究的基石，可用于評估潛在藥物化合物或環(huán)境因素的安全性。它有助于監(jiān)測細胞活力、細胞凋亡、氧化應(yīng)激和其他毒理學終點，從而能夠識別可能對細胞或組織造成風險的化合物或條件。
對于高內(nèi)涵成像(HCI)來說，至關(guān)重要的是，板的底部必須既薄又平，以促進成像所需的光傳輸。在使用板進行HCI之前，研究人員需要驗證它是否符合成像質(zhì)量標準。
圖左為：標準96孔板底部由聚苯乙烯制成，厚度為1毫米，不適合高分辨率或熒光顯微鏡。
圖右為：ibidi96孔板帶有平坦的ibidi聚合物蓋玻片 #1.5底部(180µm,+10/-5µm)，非常適合高分辨率或熒光顯微鏡。
ibidi提供專門設(shè)計的微量滴定板，旨在滿足這些應(yīng)用的嚴格要求。ibidi的板有黑色方形和圓形孔，底部平坦、透明，可確保最佳成像質(zhì)量。它們配有#1.5 ibidi聚合物蓋玻片（µ-Plate 96孔方形孔和µ-Plate 96孔圓形孔）或#1.5H玻璃蓋玻片底部（µ-Plate 96孔方形孔玻璃底、µ-Plate 96孔圓形孔玻璃底和µ-Plate 384孔玻璃底）
5. 活細胞分析
HCI非常適合活細胞分析，能夠?qū)崟r監(jiān)測動態(tài)細胞過程。它有助于研究細胞行為，例如細胞遷移、細胞間相互作用和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件。HCI使得研究人員能夠捕獲延時圖像并跟蹤長時間內(nèi)細胞表型的變化，為細胞動力學和對刺激的反應(yīng)提供有價值的見解。
ibidi提供Stage Top加熱孵育系統(tǒng)系統(tǒng)/活細胞工作站，用于使用具有ANSI/SLAS(SBS)標準格式的微孔板進行高通量活細胞成像。該系統(tǒng)可在倒置顯微鏡上輕松進行活細胞成像，精確控制溫度、濕度、CO2 和O2。
高內(nèi)涵分析（HCA）：解碼復(fù)雜數(shù)據(jù)
高內(nèi)涵分析是指利用自動化圖像分析軟件對高內(nèi)涵篩選產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)進行分析。HCA可以分析圖像中每個細胞的多個參數(shù)，每次實驗處理數(shù)千個細胞。這包括對細胞形狀、體積、質(zhì)地和熒光強度在一系列波長范圍內(nèi)的變化進行量化。HCA已經(jīng)發(fā)展到包括多細胞結(jié)構(gòu)，如3D球體和共培養(yǎng)，以及多路復(fù)用能力，從而能夠同時監(jiān)測每個孔中單個微環(huán)境中的各種特征。
高內(nèi)涵篩選的工作流程
高內(nèi)涵篩選的最新趨勢
近期HCS發(fā)展的一個主要趨勢之一是機器學習和人工智能(AI)的集成。這些技術(shù)增強了HCS系統(tǒng)的分析能力，使其能夠識別細胞圖像中的模式和特征，這些模式和特征對于傳統(tǒng)的分析方法來說可能過于微妙或復(fù)雜。例如，機器學習算法正被用于提高圖像分析的準確性和速度，包括自動分類細胞類型、量化表型變化和預(yù)測細胞對不同處理的反應(yīng)的能力。
另一個重要趨勢是成像技術(shù)本身的進步。人們一直在努力開發(fā)更高分辨率和更快的成像系統(tǒng)，以便實時捕捉詳細的細胞動態(tài)。超分辨率顯微鏡技術(shù)現(xiàn)在更頻繁地與HCS平臺配對，為細胞的分子機制提供了前所未有的見解。此外，多光譜成像技術(shù)允許同時檢測多個熒光標記，從而促進對細胞相互作用和功能的復(fù)雜研究。
HCS的應(yīng)用范圍也在不斷擴大，它能夠處理的生物復(fù)雜性也越來越大。最近的創(chuàng)新推動了能夠分析多細胞結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)的發(fā)展，例如類器官和3D細胞培養(yǎng)。這些3D培養(yǎng)物可以更好地模擬人體內(nèi)細胞的自然環(huán)境，為篩選藥物和了解疾病機制提供了新的方法，與臨床結(jié)果有更高的相關(guān)性。
參考文獻：
Schuth, S., Le Blanc, S., Krieger, T.G. et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res 41, 312 (2022).
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